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技術(shù)文章

還在為如何提取完整的外泌體發(fā)愁嗎？

更新時(shí)間：2022-04-14 瀏覽次數(shù)：2449

在過去的幾十年中，外泌體因其在改變細(xì)胞功能中的作用而受到了廣泛關(guān)注。外泌體是膜結(jié)合的納米級(jí)囊泡，最初通過晚期核內(nèi)體的內(nèi)陷形成為特定的腔內(nèi)囊泡群。由于晚期多泡內(nèi)體與質(zhì)膜融合，這些內(nèi)體來源的腔內(nèi)囊泡隨后被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，這是一種將它們與其他類型的細(xì)胞外囊泡區(qū)分開來的生物發(fā)生機(jī)制[1]。

因此，外泌體外膜由富含供體細(xì)胞膜衍生蛋白的磷脂雙層和繼承細(xì)胞質(zhì)生物分子（包括蛋白質(zhì)、酶、mRNA、miRNA 和代謝物）的水內(nèi)核組成。外泌體的大小在 20-120 nm 之間，并且在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上因親代細(xì)胞而異[2]。外泌體亞群呈現(xiàn)出不同的形狀，從球形到絲狀和細(xì)長形，還可以包括不同的子隔室[3]。

外泌體結(jié)構(gòu)及形成過程

目前，已經(jīng)開發(fā)了多種分離策略來從各種生物來源中離外泌體，這些生物來源包括牛奶、血液和尿液，以及植物衍生產(chǎn)品，例如水果和蔬菜。

外泌體利用多種內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞。有趣的是，外泌體還可以克服物種障礙，在不同來源的細(xì)胞之間傳遞生物分子[4]。外泌體介導(dǎo)生物功能，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)重要的生理和病理過程[5]

外泌體生物學(xué)功能

由于外泌體是內(nèi)源性具有生物活性的生物分子的天然載體，它們已被廣泛用于主動(dòng)和被動(dòng)傳遞合成生物分子。它們的內(nèi)源性和納米特性也使這些納米載體能夠跨越生物屏障，并賦予它們優(yōu)良的生物相容性[6]。

因此，這幾年各領(lǐng)域廣泛展開外泌體相關(guān)的研究，外泌體研究橫跨幾乎所有的研究領(lǐng)域（免疫、神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤、內(nèi)分泌、循環(huán)系統(tǒng)等）。

然而，目前用于外泌體研究的實(shí)驗(yàn)技術(shù)仍處于開發(fā)階段，許多問題仍有待改進(jìn)。例如，外泌體純化方法中，超速離心法和聚合物沉淀法（市售試劑盒）提取的外泌體中混有多種雜質(zhì)，會(huì)給后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成許多障礙。而抗體親和法和密度梯度離心法這兩種提取方法的問題在于，雖然可以提取到高純度的外泌體，但外泌體結(jié)構(gòu)不完整，無法用于分析外泌體的生理功能。

提

取

方

法

磷脂酰絲氨酸和Tim4新型外泌體提取法

外泌體膜雖然含有分泌細(xì)胞源蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，但目前普遍認(rèn)為在活細(xì)胞中磷脂酰絲氨酸（PS）通過脂質(zhì)翻轉(zhuǎn)酶作用定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)[7]。

作為通過巨噬細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡的吞噬受體（T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4，Tim4）蛋白通過細(xì)胞外域IgV域與結(jié)合了鈣離子的PS結(jié)合[8]。

利用這一原理，Wako和金澤大學(xué)醫(yī)學(xué)系免疫學(xué)華山教授共同開發(fā)一款劃時(shí)代的外泌體提取方法，利用Tim4固化磁珠，在鈣離子存在下捕捉培養(yǎng)上清和血清等樣品中的外泌體，再添加螯合劑從而提取外泌體[9]。并且MagCapture™外泌體提取試劑盒PS實(shí)現(xiàn)了比傳統(tǒng)的外泌體純化法更加簡單地提取高純度完整狀態(tài)的外泌體。

這是迄今為止取代黃金標(biāo)準(zhǔn)超速離心法的新型外泌體純化法。

應(yīng)

用

實(shí)

例

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS

巨噬細(xì)胞表面的Tim4蛋白特異性結(jié)合細(xì)胞外囊泡表面的磷酯酰絲氨酸（PS）。

利用Tim4固化磁珠，在Ca²⁺存在條件下捕捉培養(yǎng)上清或血清等樣本中的外泌體，通過使用含有EDTA的洗脫液洗脫，可獲得高純度的完整細(xì)胞外囊泡（EVs）。

原理

特點(diǎn)

●　可獲得高純度完整細(xì)胞外囊泡，可用于蛋白及核酸分析、共培養(yǎng)及體內(nèi)注射

●　回收率高

●　操作簡便（3.5h），不需超速離心

應(yīng)用實(shí)例

●　細(xì)胞培養(yǎng)上清：5 mL K562細(xì)胞培養(yǎng)上清回收1-2×10¹⁰粒子外泌體（NTA），提取得到30μg蛋白（BCA定量）。

●　血清：1 mL人血清回收5×10⁹粒子外泌體（NTA）。

對(duì)

比

分

析

外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析

通過MASS鑒定結(jié)果比較豐度最高的前 shi 種蛋白。

樣品：K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（含10%去外泌體FBS）

白色柱：源自外囊泡的人類蛋白

灰色柱：來自FBS的牛蛋白污染物

綠色：來自外囊泡的標(biāo)記蛋白

相

關(guān)

產(chǎn)

品

參考文獻(xiàn)：

[1] Hessvik, N. P., and Llorente, A. (2018). Current Knowledge on Exosome Biogenesis and Release. Cell. Mol. Life Sci. 75 (2), 193–208.

[2] Colao, I. L., Corteling, R., Bracewell, D., and Wall, I. (2018). Manufacturing Exosomes: A Promising Therapeutic Platform. Trends Mol. Med. 24 (3), 242–256.

[3] Zabeo, D., Cvjetkovic, A., L?sser, C., Schorb, M., L?tvall, J., and H??g, J. L. (2017). Exosomes Purified from a Single Cell Type Have Diverse Morphology. J. Extracellular Vesicles 6 (1), 1329476.

[4] Zhou, Y., Tian, T., Zhu, Y., Jaffar Ali, D., Hu, F., Qi, Y., et al. (2017). Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. J. Cell. Biochem. 118 (12), 4267–4274.

[5] Li, X. H., Zhang, J., Li, D. F., Wu, W., Xie, Z. W., and Liu, Q. (2020). Physiological and Pathological Insights into Exosomes in the Brain. Zool Res. 41 (4), 365–372.

[6] Akuma, P., Okagu, O. D., and Udenigwe, C. C. (2019). Naturally Occurring Exosome Vesicles as Potential Delivery Vehicle for Bioactive Compounds. Front. Sustain. Food Syst. 3, 23.

[7] Trajkovic, K. et al. (2008) Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endosomes. Science. 319 (5867), 1244–7.

[8] Miyanishi Masanori.et al. (2007). Identification of Tim4 as a phosphatidylserine receptor. Nature, 450(7168), 435-9.

[9] Nakai Wataru.et al. (2016). A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles. Sci Rep, 6, 33935.

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